Рутинные методы наблюдения и меры предосторожности при работе с клеточными культурами
Рутинные методы наблюдения и меры предосторожности при работе с клеточными культурами
После инокуляции или пересева клеток экспериментатор должен проводить рутинное исследование клеток каждый день или не более 1-2 дней. Наблюдайте за морфологией и ростом клеток, а также за изменением рН культуры, наличием загрязнений и т. д. В соответствии с динамическими изменениями клеток производят замену жидкости или пассажную обработку. При обнаружении ненормальных условий своевременно примите меры.
1. Клетки с хорошим морфологическим состоянием роста видны под общим микроскопом, с большой прозрачностью, сильным преломлением и нечетким контуром. При плохом росте клеток контур усиливается, в цитоплазме часто появляются вакуоли, липидные капли и другие частицы, просвет между клетками увеличивается, а морфология клеток неправильная или даже теряет свои первоначальные характеристики, например, эпителиальные клетки становятся эпителиоподобными. клетки. Когда клетки умирают, некоторые красители могут соединиться с распавшейся ядерной ДНК через денатурированную клеточную мембрану и сделать их окрашенными. Поэтому трипановый синий часто используется для идентификации мертвых и живых клеток. Живые клетки не окрашиваются, а мертвые ядра имеют синий цвет.
2. Рост клеток после первичной культуры или посева пересеянной клеточной суспензии, она начала пролиферировать после разных периодов инкубации. Пассированные клеточные линии, эмбриональные ткани или ткани личинок обычно обнаруживают рост клеток на следующий день и могут быть соединены в кусочки в течение недели. После того, как инокулированные клетки разрастутся по всей стенке бутылки, их следует вовремя рекультивировать. В противном случае из-за потребления питательных веществ и метаболического накопления клетки вступят в период остановки или деградации. В это время клеточный контур усиливается, а в клетках часто появляются зернистые отложения, представляющие собой набухшие митохондрии. Цитоплазма вакуолизируется, клетки становятся округлыми и шероховатыми. В серьезных случаях клетки отпадают от стенки бутылки. Только благодаря своевременному субкультивированию клетки могут продолжать расти и размножаться.
3. В нормальных условиях питательный раствор персиково-красного цвета. Если клетки поддерживают при pH 6,5 ~ 6,6, клетки отпадут и погибнут. Когда культуральная среда подкисляется и становится желтой, это указывает на то, что метаболиты в культуральной среде накопились до определенного количества, и необходимо заменить свежую культуральную среду. Если HEPES добавить в культуральную среду или культивировать в инкубаторе с 5% CO2, pH можно поддерживать относительно стабильным. Время смены питательного раствора зависит от расхода питательных веществ. При активном росте клетки ее можно менять каждые 2-3 дня, а при медленном росте ее также можно менять каждые 3-4 дня. Особое внимание следует обратить на то, что разные клетки предъявляют разные требования к значению рН.
4. Микробное загрязнение. После микробного загрязнения культивируемой клеточной культуры значение pH изменится, и культуральная среда станет мутной. После бактериального заражения из-за движения бактерий под световым микроскопом наблюдается небольшая вспышка; При грибковой инфекции под микроскопом можно увидеть множество нитевидных гиф и иногда сгруппированные споры; Микоплазменная контаминация может быть обнаружена только с помощью некоторых методов обнаружения. После загрязнения клетки ее, как правило, следует выбросить. Для важных клеточных линий вы можете обратиться к соответствующим монографиям, чтобы ввести некоторые меры по удалению загрязнения. Важные эксперименты и драгоценные клетки должны культивироваться и эксплуатироваться как минимум двумя экспериментаторами независимо друг от друга или одним человеком несколько раз (в разное время). Помимо санитарных условий культуральной лаборатории, влажность воздуха тесно связана с микробным загрязнением. Важные и длительные опыты следует проводить осенью и зимой при пониженной влажности воздуха.
Другие меры предосторожности:
Во-первых, часто наблюдайте, чтобы определить состояние клеток.
Во-вторых, добавлять ли антибиотики. Это зависит от ситуации. В процессе культивирования клеток требуется добавлять как можно меньше посторонних примесей. Антибиотики также являются нагрузкой для клеток.
В-третьих, оттаивание эмбриональной бычьей сыворотки. Сыворотку обычно хранят при -20 ℃ и размораживают в холодильнике при 4 ℃, что занимает много времени и требует размораживания за один день.